Introdução
Distúrbios pulmonares podem acometer indivíduos de diversas idades e em diferentes épocas do ano, podendo ser agudos e até tornarem-se crônicos com o passar do tempo, o que acarreta grande desconforto e limitações ao portador.
A esses distúrbios pulmonares, segundo o Ministério da Saúde (2010), pode-se relacionar a asma, enfisema, lesões pulmonares e até mesmo doenças respiratórias infecciosas, de fácil propagação pelo ar e de delicado manejo clínico, já que o pulmão, tendo a função de transportar oxigênio ao sangue, e este, aos demais tecidos do corpo, deve ter sua capacidade resguardada o máximo possível, possibilitando ao indivíduo a plena saúde respiratória e impedindo mortes precoces como, por exemplo, pelo acometimento por uma pneumonia ou por falta de oxigênio às funções básicas do corpo humano.
Estes distúrbios acometem mais de 6,4 milhões de pessoas (MS, 2016). Para remediar os episódios críticos de insuficiência respiratória são introduzidos medicamentos broncodilatadores e anti-inflamatórios (corticoides), que embora interrompam um quadro de emergência clínica do paciente, trazem consigo inúmeros malefícios a médio e longo prazo, se utilizados como tratamento às doenças pulmonares crônicas (CORRÊA; MELO; COSTA, 2008).
Por outro lado, a descoberta da conexão entre o uso das plantas e a saúde, utilizando-se preparações e fármacos derivados das plantas, ou mesmo a planta como um todo e as suas partes, viabiliza uma alternativa valiosa para o tratamento de doenças e disfunções pulmonares, sobressaindo-se em fácil acesso, menor custo, e redução de efeitos adversos e colaterais.
Corrêa, Melo e Costa (2008, p.791) pontuaram que “vários fármacos com ações contra a asma foram isolados de plantas com uso medicinal em problemas respiratórios, incluindo a atropina, a teofilina e as cromonas”. Assim, pode-se afirmar que há opções mais eficazes e vantajosas advindas da natureza que podem ser alternativas para um tratamento de longo prazo.
Dentre os trabalhos realizados que levaram à descoberta de alternativas aos tratamentos de distúrbios pulmonares usuais, uma planta do gênero Baccharis sp., encontrada na mata atlântica, vem apresentando resultados promissores. As investigações fitoquímicas realizadas com esta espécie vegetal, Baccharis retusa, levaram a identificação de terpenoides, compostos fenólicos e flavonoides (UENO et al., 2018; GRECCO et al., 2012). Dentre os compostos presentes na B. retusa, destaca-se a flavanona sakuranetina, que tem propriedade medicinal descrita em diversos estudos, os quais a atribuíram as atividades antiparasitária, antifúngica, antiviral, anti-inflamatória, antioxidante, e outras. Observou-se que a atividade anti-inflamatória é muito similar à do fármaco dexametasona, principal corticoide de uso no tratamento da asma e outros distúrbios pulmonares (SAKODA, TOLEDO et al., 2016).
Experimentos realizados in vivo em camundongos asmáticos; demonstraram que quando os animais foram submetidos ao tratamento com sakuranetina (20mg/kg por animal), houve uma redução no número de eosinófilos e de fibras elásticas nos vasos pulmonares e no parênquima pulmonar, devido à redução do estrese oxidativo e dos níveis dos fatores de transcrição no pulmão, incluindo uma diminuição na espessura das paredes vasculares pulmonares. Esses comportamentos farmacológicos observados são justificados pelos efeitos anti-inflamatório e antioxidante da sakuranetina, destacando-se a importância desses como grandes aliados no combate à asma – (SAKODA et al., GRECCO et al., 2016).
Tendo em vista a abundancia do composto da sakuranetina na B.retusa e suas atividades promissoras frente aos distúrbios pulmonares, este estudo visa a otimização no processo de isolamento deste composto por técnicas cromatográficas liquido-liquido, também conhecida como Cromatografia em Contracorrente de Alta Velocidade (HSCCC) que possibilita a separação de qualquer tipo de compostos, em grande escala, sem perda irreversível de compostos bioativos por adsorção.
Material e Métodos
Coleta do material vegetal
As partes aéreas de B. retusa foram coletadas na região de Campos do Jordão/SP, e identificadas pelo botânico Msc Guilherme de Medeiros Antar (IB-USP). Os espécimes testemunho (exsicatas) foram depositados no herbário do Instituto de Biociências da USP sob o código ANTAR 1622.
Preparo do extrato etanólico e frações enriquecidas
Após a secagem e moagem, o material vegetal; foi submetido à extração com etanol até exaustão. O extrato bruto seco foi obtido após evaporação do solvente por rotaevaporador a pressão reduzida. Devido à característica de media polaridade da flavanona sakuranetina, a fração enriquecida foi obtida por partição liquido-liquido em um sistema bifásico etanol 30% e diclorometano.
Desenvolvido o método para isolamento por Cromatografia em contracorrente, o extrato etanólico bruto das partes aéreas de B. retusa e as frações enriquecidas com sakuranetina foram submetidas à avaliação do melhor sistema de solventes bifásicos para isolamento por cromatografia em contracorrente, segundo protocolo e as “golden rules” preconizadas por ITO (2005). Para tanto, 10 mg de cada amostra foi adicionada a tubos de ensaio contendo 4 ml de diversos sistema de solventes bifásicos. De modo a calcular o coeficiente de partição (K) dos compostos presentes nas amostras, especialmente a sakuranetina, as fases superiores e inferiores dos sistemas de solventes foram separadas e injetadas em HPLC. O valor de K foi definido a partir da razão entre área de pico de cada composto em cada fase.
Os sistemas de solventes que apresentarem valores de K satisfatórios para a sakuranetina foram submetidos a fracionamento em cromatógrafo de cromatografia em contracorrente. Tal procedimento foi realizado em colaboração com a pesquisadora Profa. Dra. Fernanda das Neves Costa, do IPPN – UFRJ.
Para tanto, foi utilizado um sistema de cromatografia em contracorrente de alta velocidade (HSCCC), HTPrep – Quattro, em uma coluna de 95 mL de capacidade.
Em todas as separações, o equipamento foi ajustado para operar em fase reversa, assim sendo, fase orgânica como fase estacionária, consequentemente, a fase aquosa como fase móvel, utilizando o sistema de solvente bifásico definido anteriormente. O equipamento operou com fluxos de 2 mL/min durante a eluição e extrusão, a 860 rpm na eluição. 500 mg da fase de partição em diclorometano (BRED), enriquecida com a sakuranetina, foram solubilizadas em 5 mL do sistema de solventes bifásico e injetada diretamente na coluna.
O coletor de frações foi ajustado para 2 minutos por tubo, totalizando 4 mL por fração. As frações recolhidas foram analisadas por Cromatografia de Camada Delgada (CCD) e reunidas de acordo com a similaridade de seus fatores de retenção.
Resultados e Discussão
Como descrito anteriormente, o coeficiente de partição dos compostos presentes na fração BRED foi avaliado por meio de diferentes sistemas de solventes bifásicos (SS). Nove sistemas de solventes (A – I) foram testados, e os sistemas D, H e I, que continham respectivamente CHCl3:MeOH:H2O: 4:3:2 (D); hexano:AcOEt:MeOH:H2O – HEMWat 3:5:3:5 (H) e HEMWat 1:1:1:1 (I), apresentaram o melhor “settling time” e não emulsionaram, características favoráveis a separação por Cromatografia em Contracorrente (CCC), e assim foi submetido a determinação de K por Cromatografia Líquida de alta Performance (HPLC) (figura e tabela 1).
Figura 1. Cromatograma comparativo entre as fases superiores (U) e inferiores (L) dos sistemas de solventes D, H e I, obtido por HPLC. (Sakuranetina tR = 14 min)
Fonte: Dados de pesquisa
Tabela 1. Coeficientes de partição dos diversos componentes presentes na fase BRED
Legenda: CHCl3:MeOH:H2O: 4:3:2 (D); HEMWat: 3:5:3:5 (H); 1:1:1:1 (I); *sakuranetina
Fonte: Dados de pesquisa
Para a injeção da amostra BRED no equipamento HSCCC foram selecionados os sistemas de solventes D e I. A porcentagem de retenção da fase estacionária, frente a estas condições de operação, variou entre 75 e 83% para I – sugerindo uma resolução na separação satisfatória, segundo os critérios de ITO (2005), enquanto D não permitiu retenção satisfatória e emulsionou o sistema. Sendo assim, a amostra foi injetada no sistema preenchido por I, e foram recolhidos durante a eluição e extrusão 1 vez o volume da coluna (98 mL), sendo 25 tubos de 4 mL para ambas as etapas.
As frações recolhidas foram analisadas por CCD e reunidas de acordo com a similaridade de seus fatores de retenção, totalizando 12 grupos (BRED 1 – 12). Foi possível observar que o composto de interesse se encontrava isolado nas frações BRED 10 (0,0220mg) e 11 (0,0086 mg), com 98% de pureza (estabelecido por HPLC). Visando confirmar a identidade do composto, a amostra foi submetida a injeção em HPLC/DAD/MS-MS/MS (modo negativo), espectros de UV e MS, presentado na fig. 2.
Legenda: HRMS: m/z 285.0758 [M-H]- – C16H14O5; MS/MS: 285, 165, 119.
Fonte: Dados da pesquisa
Conclusão
A substância isolada da espécie vegetal Baccharis retusa DC (Asteraceae), a Sakuranetina, conforme estudos científicos vêm apresentando resultados promissores frente às patologias de desordens pulmonares, sendo que a principal propriedade a anti-inflamatória, apresentam efeitos similares ao medicamento de corticoide usado hoje para os tratamentos alérgicos e inflamatórios. A técnica de cromatografia em contracorrente permitiu o isolamento deste composto com um grau de pureza elevado e de uma forma rápida, em uma única etapa de 100 minutos, com injeção de 500 mg de BRED. O isolamento por HSCCC foi efetivo, permitindo assim perspectivas futuras de isolamento em larga escala e desenvolvimento de formulações para distúrbios pulmonares, especificamente asma e enfisema pulmonar, etapa futura deste projeto de pesquisa.
Referências
CORRÊA, M.F.P. MELO, G.O. COSTA, S.S. Substâncias de origem vegetal potencialmente úteis na terapia da asma. In: Rev. Bras. Farmacogn. v.18, supl., dez. 2008. p.785-797. Disponível e Acesso em : 25 jul. 2018.https://www.researchgate.net/profile/Giany_Melo/publication/228646667_Substanasvegetal_potencialmente_uteis_na_terapia_da_Asma/links/00b4953c3be9dbfdd000000/Substancias-de-origem-vegetal-potencialmente-uteis-na-terapia-daasma.pdf
GRECCO, S.S. et al., phenolic derivatives from Baccharis retusa DC. (Astereceae) Biochemical Systematics and Ecology; vol.42,21-24, 2012.
GRECCO, S.S. et al. In vitro antileishmanial and antitrypanosomal activities of flavanones from Baccharis retusa DC. (Asteraceae). Exp. Parasitol. v. 130, n. 2, Fevereiro – 2012.
ITO Y. Journal of Chromatography A – Golden rules and pitfalls in selecting optimum conditions for high-speed counter-current chromatography. 1065,2, pgs. 145-168 – 2005.
MERNAK, M.I.B. Efeito do tratamento com sakuranetina isolada de baccharis retusa em modelo murino de inflamação pulmonar aguda induzida por instilação de lps. 2014. 111 f. Dissertação (Mestrado) – Químicas e Farmacêuticas, UFSP (UNIFESP), Diadema, 2014.
SAKODA C.P.P, Toledo A.C., GRECCO S.S. et al. Sakuranetin reverses vascular peribronchial and lung parenchyma remodeling in a murine model of chronic allergic pulmonary inflammation. Acta Histochem, v. 118, n.6, jul 2016 p.615-24. Disponível em: Acesso em: 26 abr. 2019.
UENO, A.K. et al. Sesquiterpenos, diterpenos, alcenil- p-lactatos e flavonóides das partes aéreas de Baccharis retusa (Asteraceae). Sistemática Bioquímica e Ecologia, v.78, n.1, jun.2018, p.39-42. Disponível em: Acesso em 20abr.2019